Makalah Teknologi DNA

NAMA           : Nurul Ichsania Hammado

NRP                : G851130071

Program Pascasarjana Biokimia IPB

Tugas Individu Mata Kuliah Teknologi DNA

OPTIMASI EKSPRESI GEN

            Gen merupakan materi genetik yang ditulis dalam kode dan disebut DNA. Setiap gen memiliki satu set instruksi untuk membuat molekul yang dibutuhkan organisme untuk bertahan hidup. Akan tetapi, gen itu sendiri tidak dapat digunakan oleh organisme melainkan harus diubah terlebih dahulu menjadi produk gen. Ekspresi gen adalah proses dimana informasi yang terkandung dalam gen menjadi produk yang beranfaat.

            Ekspresi gen di dalam sel memerlukan dua proses, transkripsi dimana DNA berfungsi sebagai template dan ditranskripsikan menjadi mRNA dan translasi dimana informasi pada RNA akan diterjemahkan menghasilkan protein. Pengaturan ekspresi gen pada sel eukariotik hanya memungkinkan ekspresi sebagaian kecil genom dalam suatu waktu, sehingga sel dapat menjalani perkembangan dan differensiasi.

            Ekspresi gen menjadi satu prosedural yang penting dalam teknologi manipulasi DNA karena termasuk dalam salah satu metode pada teknologi rekombinan yang berfungsi untuk memperbaiki kualitas produk genetika untuk keberlangsungan mahluk hidup. Keterkaitan antara teknologi rekombinan DNA dengan penanggulangan masalah sosial menjadi perhatian utama dari dulu hingga sekarang. Contohnya dalam penanggulangan masalah kesehatan melalui pembuatan antibiotik, antiinflamasi, atau jenis-jenis obat lainnya yang menggunakan teknik rekombinan dengan pemanfaatan mikroba.

            Seperti metode-metode pada umumnya, optimum tidaknya proses ekspresi gen dapat diketahui dengan memahami beberapa faktor-faktor yang mempengaruhi proses ekspresi genetika. Beberapa faktor tersebut selanjutnya dibahas berikut.

1.      Pemilihan Promotor

Defenisi promotor merupakan agen spesifik yang dikenali oleh RNA Polimerase sebagai faktor yang menyebabkan berlangsungnya proses transkripsi. Promotor merupakan bagian dari gen (sekuen DNA) yang memiliki fungsi untur mengatur ekspresi gen pada tahapan transkripsi. Cara kerja promotor yaitu, promotor akan dikenali pertama kali oleh RNA Polimerase, dimana di daerah ini mengandung beberapa basa yang hampir sama yang membentuk rangkaian TATA, disebut juga TATA boks. Proses ini seringkali juga disebut tahapan inisiasi atau pengenalan sebelum sintesis RNA.

Pemilihan jenis promotor akan menentukan banyaknya protein yang akan dihasilkan selama proses ekspresi genetik. Proses seleksi promotor tidak sedikit mempengaruhi tingkat ekspresi lokasi ataupun waktu berlangsungnya ekspresi gen. Jenis promotor sendiri memberikan pengaruh secara spesifik pada daerah koding. Ada promotor yang tingkat produksi proteinnya sangat banyak. Seringkali disebut promotor kuat, karena kemampuannya yang memproduksi protein tersebut dalam jumlah yang cukup banyak.  Promotor ini disebut promotor konstitutif. Disebut demikian karena promotor ini akan diekspresikan selamanya oleh organisme tersebut selama masa hidupnya. Contoh promotor ini banyak digunakan pada level ekspresi tinggi dan berlangsung secara terus-menerus.

Jenis promotor berikutnya adalah promotor terinduksi, yang apabila dipahami maka promotor ini dibuat untuk dikontrol produksi jumlah proteinnya. Karena tidak semua proses rekayasa genetika membutuhkan protein dalam jumlah yang besar. Adakalanya juga jumlah protein yang banyak akan menyebabkan penekanan pada ekspresi gen dan menyebabkan terhentinya produksi protein di dalam sel. Karena jumlah yang banyak ini pula, lantas promotor tersebut akan bersifat toksik (merusak atau bahkan menyebabkan kematian). Promotor induksi juga dihasilkan hanya dalam keadaan khusus tergantung pada keberadaan senyawa atau kondisi lingkungan. Contoh promotor ini adalah untuk ekspresi gen bakteri yang resisten antibiotik. Pada kondisi ini, ekspresi gen diatur dengan pemberian senyawa penginduksi.

2.      Penggunaan Enhancer

Enhancer dapat juga diartikan sebagai urutan DNA yang mempengaruhi, menstimulasi ekspresi gen sebagai aktivator, berfungsi tanpa terpengaruh pada posisi dan orientasinya. Pemanfaatan enhancer dimaksudkan untuk meningkatkan ekspresi gen beberapa kali lipat. Optimasi enhancer dapat dilakukan dengan mempertimbangkan kombinasi dengan promotor dan inang.

Beberapa karakteristik dari enhancer adalah aktif pada gen yang jauh jaraknya (ribuan nukleotida), terletak sebelum atau sesudah gen, dapat diregulasi oleh faktor yang bisa berdifusi.

3.      Pengaruh mRNA

Kestabilan mRNA menentukan jumlah level ekspresi gen. Diketahui jika stabilitas mRNA prokariotik tidak stabil jika dibandingkan mRNA eukariotik. Hal ini disebabkan karena organisme eukariotik memiliki paruh waktu lebih lama, yakni dalam hitungan jam dan hari, ketimbang paruh waktu yang dimiliki oleh organisme prokariotik yang berlangsung dalam hitungan menit. Penentuan waktu paruh dapat dilihat dari urtan ujung 3^` mRNA.

4.      Keberadaan Intron dan Ekson

Intron adalah bagian sekuen DNA yang tidak diterjemahkan, sedangkan ekson adalah bagian penting dalam urutan (sekuen) DNA karena merupakan bagian yang akan diterjemahkan. Dalam proses rekayasa genetika antara dua jenis organisme yang berbeda yakni dari satu gen eukariotik kepada prokariotik, terjadi penghilangan atau peniadaan bagian intron dari gen tersebut. Karena ada beberapa prokariotik yang tidak mampu membaca bagian intron dari suatu gen. Sebagai tambahan, gen prokariotik tidak mengandung intron.

5.      Pemilihan Jenis Kodon

Kodon adalah susunan deretan nukeotida yang terdapat pada mRNA yang merupakan kombinasi dari tiga nukleotida berurutan berfungsi untuk menyandi suatu asam amino tertentu juga sering disebut triplet kodon. Optimasi kodon dapat dilakukan dengan meniadakan bias kodon yang dapat menghambat produksi protein rekombinan pada system prokariota. Untuk beberapa kasus, ada kodon yang harus dioptimasi dulu baru selanjutnya ditransformasi.

6.      Plasmid

Plasmid merupakan materi DNA yang bertugas untuk membawa gen asing untuk selanjutnya ditransformasikan ke dalam sel inang sehingga dapat bereplikasi. Beberapa keunikan dari plasmid adalah ukurannya yang kecil sehingga mudah untuk bertransformasi, memiliki kemampuan bereplikasi lebih banyak di dalam sel inang (host), dan memiliki bagian restriksi di bagian-bagian tertentu. Hubungan jumlah salinan plasmid dengan optimasi ekspresi gen adalah semakin banyak salinan plasmid yang dimasukkan ke sel inang, maka semakin besar pula jumlah transforman yang dihasilkan. Hal ini disebabkan oleh peningkatan proses introduksi.

Plasmid memiliki tingkat kestabilan yang dipengaruhi oleh agen resistensi. Keberadaan agen resistensi akan menyeleksi mikroorganisme mana yang tahan (resisten) terhadap antibiotik. Mikroorganisme yang tidak memiliki kemampuan resistan terhadap agen penyeleksi akan mati. Agen penyeleksi ini banyak dimanfaatkan dalam produksi skala laboratorium sebagai uji toksik yang menghitung laju pertumbuhan mikroba sebelum dan setelah pemberian agen resistensi.

7.      Sel Inang

Inang (host) merupakan sel tumpangan dimana plasmid ataupun vektor akan diinjeksikan agar dapat bereplikasi. Sel inang yang baik adalah yang stabil dan mampu bereplikasi dalam waktu singkat, pertumbuhannya banyak, tidak bersifat patogen, sesuai dengan vektornya, dapat menjaga stabilitas gen asing sehingga gen asing tersebut dapat bereplikasi dengan baik.

Ada beberapa fase yang harus dilalui mikroorganisme, diantaranya adalah:

a.       Fase adaptasi, fase ini merupakan periode dimana mikroorganisme melakukan penyesuaian dengan lingkungan sekitarnya atau medianya. Lama proses ini bisa terjadi dalam hitungan jam ataupun hari, tergantung jenis mikroorganismenya. Jika fase ini mampu dilalui, maka mikroorganisme selanjutnya menuju fase pertumbuhan.

b.      Fase pertumbuhan merupakan periode dimana mikroorganisme mengalami perkembangbiakan secara cepat seiring dengan peningkatan jumlah sel yang membelah. Fase pertumbuhan banyak dipengaruhi oleh suhu, pH, kondisi media dan nutrient yang tersedia dalam media.

c.       Fase selanjutnya disebut fase stasioner atau fase stabil. Pada fase ini keseimbangan terjadi antara laju pertumbuhan dan laju kematian. Dalam fase ini mikroorganisme banyak menghasilkan metabolit sekunder.

d.      Fase terakhir disebut fase kematian. Disebut demikian karena pada fase ini laju kematian lebih besar dibandingkan dengan laju pertumbuhan. Bisa jadi disebabkan laju pertumbuhan yang semakin meningkat sedangkan nutrient yang ada pada media tidak bertambah.

8.      Faktor Kondisi dan Lingkungan

Optimasi  kondisi lingkungan dapat dikontrol dengan pH optimum dan  tempratur optimum, dimana setiap mikroorganisme memiliki kedua faktor optimum ini dalam skala yang berbeda-beda. Faktor berikutnya yakni kadar oksigen. Untuk bakteri aerob dan anaerob, keduanya memiliki kebutuhan kadar oksigen untuk mlekukan proses ekspresi gen yang berbeda-beda. Bagi mikroorganisme aerob, oksigen yang dibutuhkan jauh lebih banyak jumlahnya jika dibandingkan dengan bakteri anaerob. Kondisi terakhir yang perlu dioptimumkan yakni komposisi media. Komposisi media harus disesuaikan dengan jenis mikroorganisme yang digunakan untuk ekspresi gen. Salah satu contoh optimalisasi komposisi media adalah dengan pemanfaatan bioreaktor sebagai media fermentor.

         

   Selain optimasi faktor-faktor di atas, ada pula cara optimasi ekspresi gen lainnya yang berlangsung di era moderen. Metode tersebut seringkali disebut metode manipulasi DNA atau teknologi rekombinan. Teknologi rekombinan tersebut berkembang seiring dengan perkembangan zaman. Beberapa diantaranya adalah metode pemisahan molekul DNA menggunakan elektroforesis pada berbagai ukuran. Ada juga pemurnian molekul DNA yang dilabel secara spesifik dengan radioisotope atau penanda kimia secara in vitro. Metode selanjutnya yakni southern, northern blotting dengan proses hibridisasi; DNA Library; atau bahkan dengan menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR). Metode PCR merupakan teknologi rekombinasi DNA dengan cara mengamplifikasi (perbanyakan) utas DNA. Beberapa langkah yang umum dalam proses PCR yakni Inisiasi (Pengenalan), Annealing (Penempelan), Elongasi (pemanjangan), dan Amplifikasi (Perbanyakan).